. Zusammenfassend steuert phy4 das Richtungswachstum in Moosfilamenten und signalisiert damit notwendigerweise im Zytoplasma und nicht über die Transkriptionsregulation im Zellkern. Wie dieses zytoplasmatische Signal entsteht, ist nicht bekannt, aber es könnte sich aus der physikalischen Wechselwirkung von Phy4 mit Phototropin an der Plasmamembran ergeben (Jaedicke et al., 2012). In der vorliegenden Studie haben wir eine Reihe neuartiger HIPes identifiziert und charakterisiert, die sich alle zumindest teilweise im Zytoplasma befinden, ebenso wie ihre Wechselwirkungen mit Phy4. Die meisten werden in höheren Pflanzen konserviert. Unsere Erkenntnisse und ihre mögliche Bedeutung werden im Folgenden näher erläutert . . . Die Autoren erklären, dass die Forschung in Ermangelung von kommerziellen oder finanziellen Beziehungen durchgeführt wurde, die als potenzieller Interessenkonflikt ausgelegt werden könnten. . . .
AD:HIP4 und AD:HIP6 Konstrukte wurden durch Phusion-Verstärkung von cDNA geklont, subkloniert in pCR bluntII TOPO (Invitrogen) und ClaI/SacI Klonen in pGADT7. Alle anderen Konstrukte von Kandidaten-Phy4-interagierenden Partnern wurden durch Gateway-Klonen erhalten. Durch Phusion-Verstärkung von cDNA in einer 2-stufigen PCR-Version wurden AttB1- und attB2-Standorte an das Produkt angeschlossen. Bei N-Terminal- und C-Terminal-Tags wurde das CDS mit bzw. ohne Stop-Codons verstärkt. Gelgereinigte PCR-Produkte wurden mit BP-Clonase (Invitrogen) in pDONR207 geklont. PRL1- und PLP-Eintragsklone wurden durch TA-Klonen von PCR-Produkten in pCR8GW TOPO (Invitrogen) erstellt. Die resultierenden Eintragsklone in voller Länge wurden verwendet, um Ausdruckskonstrukte für Y2H-Assays und zytologische Analysen über die LR-Reaktion zu erstellen. Die Inserts wurden in AD: und :AD Beutevektoren pGADT7g (Uetz und Grigoriev, 2005) und pGADCg (Stellberger et al., 2010) rekombiniert und zusammen mit BD:phy4 und phy4:BD Holophytochromködern für semiquantitative Wachstumstests in Hefe umgewandelt, um die Wechselwirkung und ihre potenzielle Lichtabhängigkeit zu überprüfen. Dazu wurden auf TSD-Medium mit 3-AT- und 30-M-Leiterplatte 2 x 105 doppelt transformierte Hefezellen gesichtet und 5 Tage lang in kontinuierlichen 0,7 -mol m-2 s-1 (Rc) oder 12 min/h rot leuchteten (660 nm LEDs, 4 mol m-2 s-1) Impulse (Rp) oder rot gefolgt von 12 min/h far-red (740 nm LEDs, 5 mol m-2 s-1) Impulse (Rp+FRp) oder Dunkelheit (D). Verschiedene Kontrollen wurden eingeführt, um sicherzustellen, dass geeignete Wechselwirkungen überwacht wurden (siehe auch Jaedicke et al., 2012).
Die konstitutive Verkleinerung wurde durch BD:phy4 und phy4:BD Köder in Kombination mit der AD:phy4 Beute demonstriert. Als Negativkontrollen und zur Einstellung geeigneter 3-AT-Konzentrationen wurden BD:phy4 und phy4:BD Köder mit dem leeren pGADT7-Vektor kombiniert (von diesem 2,5 mM oder 1 mM wurden 3-AT für doppelt transformierte Hefewachstumstests verwendet). Als Kontrolle für eine erfolgreiche Holophytochrombildung wurden BD:phyA (in pGBKT7) und phyA:BD (in pBAC) Köder mit AD:FHY1 (1 mM 3-AT) kombiniert, da diese Y2H-Wechselwirkung pfr-abhängig ist (Hiltbrunner et al., 2005). . . Wie im Abschnitt “Einführung” erläutert, besteht zwar kein Zweifel daran, dass das zytoplasmatische Signal, das vektorielle Informationen speichert, aus Phytochromen in unteren Pflanzen stammt, aber es ist unklar, ob eine verwandte Funktion in höheren Pflanzen vorhanden ist. In ähnlicher Weise, während phy4-phot Interaktion an der Plasmamembran etabliert wurde und wahrscheinlich mit vektoriellen Signalisierung in Moosen verbunden sein wird, ist die Situation in höheren Pflanzen weniger klar. Wir hoffen, dass mit der Aufklärung des Moossystems nützliche Hinweise auf letztere und/oder die Entwicklung der Phytochrom-Signalisierung auftauchen. .
. . Holophytochrom-interagierendes Protein 3 (37,4 kDa) trägt CHY, CTCHY und C3HC4 (bezogen auf ein spezielles Cystein-Histidin-Muster) RING-Typ ZF-Domains.
